稻曲毒素含量与致病力关系探析论文

2020-09-25 14:58:23 45

材料和方法

粗毒素的提取。从1g新鲜米曲球的外层刮下粉末，然后分别以80mL的水，甲醇和丙酮萃取60分钟。超声处理30分钟，然后通过双层滤纸过滤。通过真空浓缩滤液获得的浆液是粗毒素。每种提取方法重复3次。

测定粗毒素的生物活性。在一个9cm的无菌培养皿中，内衬双层灭菌滤纸，用7mL毒素溶液润湿滤纸（用水稀释在1.1至25mL中获得的粗毒素浆液），并加水作为对照。次氯酸钠在表面消毒90秒钟。用无菌水冲洗后，将其置于培养皿中。每个培养皿中20粒谷物在28°C下培养4天，并根据需要进行保湿。每道菜调查了15粒谷物的根长，每次处理重复3次。整个测试重复两次。胚根伸长的抑制率＝ [（对照胚根的平均长度-处理胚根的平均长度）/对照胚根的平均长度]×100％。

粗毒素的成分分析。通过HPLC检测粗毒素，用水稀释，通过0.45μm微孔滤器过滤，并通过高效液相色谱法Agilent 1200进行分析。色谱柱为EclipseXDB-C18（4.6×250mm，5μm）;流动相为水-甲醇-甲酸（400s70s1，V / V）;流动相流速为0.8mLmin-1；柱温为40°C;样品进样量为20μL;紫外线检测波长为254 nm。 1.3.2质谱分析用水稀释粗毒素，并通过0.22μm微孔膜过滤，然后使用来自ESI的Agilent 6410三重四极杆质谱仪进行分析。质谱条件：ESI源（+）；气体温度350℃；气体流量10Lmin-1，雾化器压力45psi;毛细电压（毛细电压）4000V;分段电压：135.0V； 175.0V； 200.0V;扫描范围m / z100-800。

a黄曲霉毒素A的检测方法。在全国5个稻区的224个稻曲中检测到毒素A含量。刮去每个饭团样品的粗大的孢子，充分混合后称取0.1g粉末作为测试样品。大米黄曲霉毒素A按照1.1的方法用水萃取，HPLC按照1.3.1的方法检测。由于没有米曲霉A的标准，因此将从南京收集的一部分曲霉球粉用作参考样品，并连续5次测量平均峰面积M。参考样品与每5个样品同时进行测试，并且在参考样品具有稳定的峰面积（m±10％）的前提下，认为测试数据有效，因此每个样品的峰面积样本可以相对比较。样品的相对真实水平。

用于测定of曲霉致病性的方法。 2010年的现场试验2011年，该试验在江苏省农业科学院西水基地试点进行。据张俊成等。

方法，确定了52株米曲霉菌株在实验室中的致病性。挑选单个孢子纯化的米曲菌株并转移至PSA培养基中，并在28℃下培养15天。在菌株的生长边缘取一个直径为3.5mm的打孔器，将12个菌丝体放入装有20mL PS培养基的50mL离心管中，并在28°C和130r / min的条件下摇动培养。接种含有孢子和菌丝的混合物。用注射器注射，每只耳1 mL，每种菌株接种10只耳，并在接种后标记。收获前15天调查接种结果。对于每个米曲霉，调查了米曲球和8耳朵患病耳朵的数量，以对疾病发生的程度进行分类。分级标准参照唐春生等的方法。

结果

不同提取方法获得的米曲霉粗毒素的生物活性。用纯水，甲醇和丙酮与三种不同的极性溶剂萃取，得到的粗毒素对小麦胚根生长的抑制程度不同。其中，纯水和甲醇萃取得到的粗毒素对小麦胚根伸长具有较强的抑制作用，抑制率分别为59.6％和52.9％。它们之间没有显着差异。丙酮提取的粗毒素和CK之间没有显着差异。

米曲霉及其主要活性成分的粗毒素分析。将三种萃取方法得到的粗毒素用纯水稀释，通过0.45m微孔滤器，然后进行HPLC检测。每个色谱峰均用VWD进行UV扫描。将水-甲醇-甲酸，水-甲醇-乙酸和水-甲醇-磷酸作为流动相进行比较，发现磷酸的色谱峰类型最佳，其次是甲酸，而乙酸是最糟糕的。考虑到随后的样品纯化需要使分析型HPLC和制备型HPLC的工作条件尽可能保持一致，因此本研究使用水-甲醇-甲酸流动相系统。同时，比较了不同体积比的水-甲醇分离效果。测量结果表明，当流动相中水与甲醇的体积比为400s70时，各种组分的分离效果和重现性最佳（图1）。甲醇和水萃取得到的粗制毒药普通色谱图中疑似黄曲霉毒素A的11.394min组分（图略）和11.385min组分（图1组分ii）的峰面积相似，但水萃取的峰形较好，杂质少。早期。几乎没有从丙酮中提取可疑成分。色谱结果与生物毒性试验结果一致。对从甲醇和水提取物中得到的可疑成分进行了UV扫描，发现扫描结果几乎相同：分别在207、254和290 nm处有三个吸收峰。 ），这与文献中水稻黄曲霉毒素A的紫外线吸收特性是一致的[5,9]。由于米糠假单胞菌的厚孢子含有大量脂溶性颜料杂质，所以用纯水提取时，漂浮在提取液表面上的厚孢子粉的问题不能完全浸入液体中。因此，通过向水中添加少量甲醇来纯净提取米曲霉毒素A。用纯水稀释粗毒素，并使其穿过0.22m的微孔膜进行LC-MS分析。总离子流图如图3所示，质谱图如图4所示。组分（I）在6.073min处的ESIm / e为645.9（M + H）+，组分（II）为11.444min ESIm / e是673.9（M + H）+，组分（Ⅲ）为14.058min ESIm / e是558.9（M + H）+，15.362min组分（IV）ESIm / e是494.9（M + H）+，与国外已发表文献中的米曲霉毒素B（M + H，646），A（M + H，674）和C（M + H）的含量。 （559），D（M + H，495）的相对分子质量基本相同。由于质谱图中峰II的保留时间（图3）与高效液相色谱图中峰ii的保留时间（图1）非常接近，结合了UV吸收光谱（图2），因此初步证明了HPLC图中的成分ii为黄曲霉毒素A。

不同地区大米毒素A相对含量的比较和差异。米曲霉产米曲霉与该地区致病性之间的相关性分析。从中国的5个水稻地区收集了224份米曲霉样品，并通过HPLC检测了样品中毒素A的相对含量。试验结果（表1）表明，不同地区稻曲的平均含量差异很大。四川地区黄曲霉毒素A的平均水平最高（995），是江西最低平均水平（535）的1.86倍。不同区域中高含量样品的比例也有很大差异。从四川采集的29份样品中，有15份为高含量样品，占51.7％。从江西采集的21个样品中，只有2个是高含量样品。占9.52％。确定了来自全国7个省的52个米曲霉菌株对易感品种两优培九的致病响应和毒素A的产生。结果显示（表2），52株米曲霉菌株的致病性分化非常显着。 （疾病指数7.5-100），毒素A的量也有显着差异（最高产量是最低产量的2.7倍）。使用SPSS17.0分析软件制作了52个菌株产生的水稻黄曲霉毒素A的量及其致病性（疾病指数）的二维散点图（图5），相关系数R = 0.222，显着概率P = 0.114，无统计学意义。分析结果表明，米曲霉菌株产生的毒素A量与其致病性之间没有显着相关性。

讨论

植物病原性毒素是植物病原体产生的代谢产物，对宿主植物有毒，并经常在由病原体感染引起的病原定植过程中发挥重要作用，是导致植物病害发生的主要因素之一。康振生等。

发现当禾谷镰刀菌的菌丝体仍在宿主表面上扩展而没有侵袭宿主细胞时，病原体就产生了脱氧富沙雷诺毒素DON的分泌。随着宿主组织中DON浓度的增加，宿主细胞发生了一系列病理变化。宿主细胞坏死后，病原体进入坏死宿主细胞定居。在病原性毒素的应用中，多种病原性毒素已用于筛选抗病品种或抗病突变体的抗性筛选[18-19]，以及水稻曲霉在米曲霉的致病过程中的作用。不清楚。同时，常规方法在对稻瘟病抗性的评估中有一定的局限性，它已成为限制选择高抗性品种的主要因素之一。深入分析米曲霉可以为进一步阐明米曲霉的致病机理提供科学依据，并为米曲霉的抗性育种提供新途径。

该实验室的早期研究发现，在米曲霉培养物中抑制小麦胚根生长的活性成分，但是无论是用有机溶剂萃取还是用水萃取，都无法在高效液相中检测到曲霉。 A，我转向从米曲中寻找毒素A，发现水和甲醇都能在选择萃取溶剂时获得毒素A。在这项研究中，通过在水中添加少量甲醇来提取粗毒素，并使用LC-MS扫描粗毒素中的多种活性成分。发现有四个成分（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）。米曲霉毒素B（M + H，646 A（M + H，674），C（M + H，559），D（M + H，495）的相对分子质量是一致的，因为质谱中的基团馏分Ⅱ的保留时间（11.444min）非常接近Mou A Carbobenzine的组分HPLC色谱图（11.385min），结合紫外吸收光谱（图2），已初步证明了稻米中的粗毒素已经被由高效液体检测到的毒素A