PCR方法在蕲蛇中的鉴别实践论文
2020-01-15 07:05:01 176
近年来，由于of蛇的大量捕获和利用，of蛇的药材资源不断减少，导致药材短缺，价格上涨，市场上已经出现了许多假货。因此，of蛇的识别已成为保证药材质量的关键。传统的毒蛇识别方法主要是形态学，但是形态学技术的鉴定需要丰富的经验和对毒蛇完整性的高要求，并且在识别不同的毒蛇品种方面存在一定的困难。随着生物学的发展，many蛇的鉴定也应用了许多生物学方法，为opened蛇的鉴定开辟了新的领域。本文介绍了通过PCR方法对of蛇的鉴定。
1原料和方法
1.1原料
1.1.1试验药物原料
毒蛇对照品均来自中国食品药品认证所（批号：121592-201201），毒蛇1号（苏州雷云上制药有限公司赠予），毒蛇2号，红色运动蛇，中国水蛇形态确认。
1.1.2仪器和试剂
高速低温离心机（Thermo Scientific Biofuge primo R），凝胶成像系统（GEL DocTM XR + BioRAD），电泳仪（Bio-RAD Power） Pac TM Basic），PCR仪（ABApplied Biosystems）。 DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，吸附柱批号：M1104），DREAM Taq Green PcrMaster Mix（2×）（Thermo Scientific产品，批号：00108596），引物在上海神工（批号：9301839997）和9301839996），GelRed（购自BIOTIUM，批号：11G0127），100bp DNA Ladder（TIANGEN产品）。
1.2方法
1.2.1模板DNA的提取
（1）制备测试样品DNA：取0.5克切碎的蛇肉，放在研钵中，加入适当量的液氮，充分研磨成粉末，将20mg放入1.5ml离心管中，按照DNA提取试剂说明手册的步骤提取DNA，并将提取的测试DNA储存在-20°C以便将来使用。
（2）参考DNA的制备：将20mg Viper参考物质放入1.5ml离心管中，并按照上述方法提取Viper参考物质的DNA。
1.2.2。 PCR反应
鉴定引物：5'GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT'3和5'CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC'3。 PCR反应系统：在200μl离心管中进行，总反应体积为25μl，DREAM Taq Green Pcr Master Mix 12.5μl，20μM引物各0.75μl，DNA模板1.25μl，去离子水9.75μl。将PCR反应参数在95°C下预变性5分钟，循环30次（95°C 30s，63°C 45s），并在72°C延伸5分钟。
1.2.3电泳检测
运行缓冲液为TAE，凝胶浓度为1.2％，将核酸凝胶染料GelRed加入到融化的琼脂糖中；试验产物与对照药物之间的PCR反应溶液的上样量为8μl，DNA分子量标记的上样量为6μl，5V / cm，电泳时间约为50分钟。电泳完成后，取出凝胶切片并在凝胶成像仪上检查。
1.3结果的判断
凝胶电泳图谱，真正的蛇蛇在与参考药物的凝胶电泳图谱相对应的位置具有单个DNA条带（291bp）。
2结果
control子的振动控制产品和真品显示相应的扩增带，但未出现vi子混淆产品（假货）。带。
3讨论
目前，识别毒蛇的经典方法是形态学，但需要丰富的经验，市售的毒蛇蛇是部分醋。 -治疗。毒蛇般灼热的部分失去了个人的完整性，这更有利于非法商人制造假冒和掺假产品，并使用大量令人迷惑的产品充当真正的毒蛇。由于在醋烧过程中草药的外观，皮肤和骨骼都有不同程度的变化，这给识别蛇牙草的特性带来了很大的困难。本文根据中国药典的方法，选择了两种原汁原味的vi蛇和vi蛇常见混杂产品（中国水蛇和红色训练蛇）和vi蛇对照材料进行PCR鉴定，该方法可以准确地鉴定蕲蛇的真伪和蛇毒。令人困惑。这项研究表明，PCR方法的鉴定可以更好地克服传统方法的弊端，并在DNA水平上准确鉴定蛇蛇的加工产物。 PCR方法不依赖经验和蛇的完整性，判断结果更加直观，客观，可靠。该方法具有快速，准确，操作简便的特点，可用于药用材料的分子鉴定。
